突发奇想：用蛇的基因替换老鼠基因为哪般？-凯发游戏

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撰文 | 汤   波

责编 | 陈晓雪

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2016年10月20日，美国《细胞》（cell）杂志刊登一篇有趣的故事，美国劳伦斯伯克利国家实验室的科学家在研究蛇的进化过程中，突发奇想地用蛇的一段dna将小鼠的同源dna进行替换，结果小鼠的四肢明显变短，似乎像蛇一样不长腿了。原来，蛇的祖先是有四肢的，在进化过程中由于这段dna功能发生变化，导致四肢慢慢消失了。

全球现存蛇的种类多达3000多种，虽然与蜥蜴等同属爬行动物，但是却看不到四肢，主要靠腹部的鳞片“滑行”。大多数人都把蛇看成是无腿的爬行动物，以至于中国历史名著《战国策》中那位“画蛇添足”的仁兄，因为给蛇画上了腿，既没有喝到酒，更被后人耻笑了两千年。不过最新考古发现，蛇也曾长过腿，而且还长了四条腿。

2015年7月24日的美国《科学》（science）杂志公布了一项惊人的考古新发现，英国朴茨茅斯大学的戴夫·马蒂尔（dave martill）博士在一家德国索伦霍芬博物馆里参观时，意外地发现一块在巴西出土、距今已有1.1亿年的白垩纪化石上，竟然有一条长有四条腿的蛇。通过仔细分析和比对，马蒂尔博士等人认为这块化石的确是蛇类化石，而非蜥蜴的，因为这个化石上的动物身体修长，有类似蛇的牙齿和一排用于爬行的腹鳞。

这条已沉睡上亿年的古蛇标本被从巴西挖掘后，辗转来到德国索伦霍芬博物馆，只是作为白垩纪大型化石展的一个普通化石进行展览，很长时间并没有引起人们的注意，直到马蒂尔博士发现了它。或许是因为它太小了，这条古蛇的体长仅为20厘米，研究人员推测它应该是条幼蛇，它的前腿只有约1厘米长，而后腿则稍微大一些，而且四肢均有明显的五指，可能便于抓捕猎物或者辅助交配。

蛇起源于一种已灭绝蜥蜴的假说，之前已被多个只有两只后腿的蛇化石标本所证实，不过一直缺少四脚蛇化石的直接证据，因此马蒂尔博士等人的发现正好填补了这一空缺。在这些只有后腿的蛇化石考古发现中，大多数研究都将蛇的祖先指向海洋蜥蜴——沧龙，一种与恐龙同时代、并同恐龙一起灭绝的海洋大型生物。不过，根据这条四脚蛇的头盖骨和身体的比例，以及缺乏像大多数海洋动物一样扁平的尾巴等特征，马蒂尔博士等人推测这种蛇是由陆地上的掘穴蜥蜴而非海洋蜥蜴进化。

►长有四肢的蛇化石、前腿和后腿及复原图（源自life science网站）

但是，蛇的腿为什么会退化呢？最近，一些分子生物学家找到了另外的答案。为了弄明白蛇的四肢退化原因，美国劳伦斯伯克利国家实验室阿卡索·维瑟尔（axel visel）教授领导的研究小组将目光聚焦在一个叫音猬基因（sonic hedgehog gene）的远距离增强子zrs上。

音猬基因是胚胎发育一种非常重要的基因，对胚胎体节发育和肢芽形成起着重要作用。音猬基因首先在果蝇身上被发现，因该基因突变的果蝇胚胎呈多毛团状，酷似受惊刺猬而得名，几乎存在于所有动物和人。而zrs增强子位于音猬基因的上游约100万个碱基对的位置，对脊椎动物四肢发育至关重要。一旦这个增强子序列发生突变，可能导致动物的四肢发育异常，其中一些突变导致了人的多指症。

研究人员分析了6种蛇类的zrs增强子序列，包括缅甸蟒蛇、红尾蚺、扁颈眼镜蛇、斑点响尾蛇、极北蝰和玉米蛇，分别代表蛇类进化过程中的不同形态阶段，其中前两种蛇还保留有后肢残迹，后四种蛇的四肢则完全退化。在将这些序列与人、小鼠、牛、海豚、象鼻鲨、鸡、蝙蝠、蜥蜴和腔棘鱼等其它16个物种的同源序列进行比对后，研究人员惊奇地发现这6种代表性蛇类的zrs增强子均缺失了一段17个碱基对序列，其中玉米蛇的zrs增强子序列则全部缺失，这也是zrs增强子区域内唯一的一段在所有蛇类全部缺失，而在蜥蜴和鱼类等其它物种中都高度保守的序列，因此推测其与蛇的四肢退化有关。

为了进一步研究这些增强子zrs缺失序列的功能，维瑟尔教授研究小组利用crispr/cas9这一最新的基因组编辑技术，将小鼠增强子zrs序列替换成其它物种的同源序列，包括人和腔棘鱼的序列。在这些基因序列被替换的小鼠胚胎中，研究人员观察到，替换成眼镜蛇zrs序列的小鼠完全检测不到音猬基因的表达，蟒蛇zrs序列替换小鼠则只有极其微弱的表达，但是这些小鼠的四肢均显著缩短，而且成年后四肢也没有能长出，而其它物种的zrs序列均没有影响小鼠的四肢发育，就连本身不长腿的海豚、鲨鱼和腔棘鱼等鱼类zrs序列也没有蛇类zrs序列的威力，序列替换后小鼠的四肢也发育正常。

►被蛇的增强子zrs序列替换后，小鼠四肢发育不全（ez kvon et al., 2016)

显然，缺失17个碱基对序列的音猬基因增强子zrs越来越像是蛇类四肢退化的“罪魁祸首”了，这一进化史上的悬案似乎结案了，但是维瑟尔教授研究小组研究得正起劲，完全没有停下来的意思，很快，他们又将这一段缺失序列补回到蟒蛇的增强子zrs上，同样采用crispr/cas9技术，将该重构的蟒蛇zrs序列替换掉小鼠的同源序列，结果小鼠的四肢发育完全正常，进一步证实了蛇类音猬基因增强子zrs的17个碱基对序列缺失是蛇类四肢退化的主要原因。

不过维瑟尔教授研究小组让小鼠来验证增强子zrs的功能并非首创，应该是受日本科学家的启发。早在2005年，日本国家遗传学研究所tomoko sagai等人将小鼠的音猬基因增强子zrs全部删除，得到的小鼠四肢也大大缩短，第一次利用基因工程小鼠模型证明了增强子zrs对动物四肢发育至关重要的作用。维瑟尔教授研究小组发现完全缺失增强子zrs序列的玉米蛇也正与这一研究结果相吻合。

►zrs序列删除的小鼠四肢也表现出发育不全（tomoko sagai et al., 2005)

也可能有人会脑洞大开，如果用蜥蜴的zrs序列将蛇的同源序列替换掉，会不会培育出拥有四只脚的蛇呢？正如维瑟尔教授研究小组2016年10月20日在美国《细胞》杂志上论文所声称的那样，他们并不希望制造出这种四脚蛇，而且可能还存在其它的基因或调控序列对动物四肢的发育起到一些重要作用。

几乎就在维瑟尔教授研究小组发表论文的同时，美国霍华德·休斯医学研究所的弗朗西丝卡·利尔（francisca leal）和马丁·科恩（martin cohn）也在《当代生物学》（current biology）发表论文，公布了他们所发现的蟒蛇后肢并没有完全退化的秘密，同样也涉及音猬基因调控四肢发育的特异增强子zrs突变，除了维瑟尔教授研究小组发现的那个缺失片段，他们还发现了该增强子的另外两段缺失序列都可能也与蟒蛇后肢并没有完全退化有关，而这三段缺失的序列共同作用，使得蟒蛇的zrs增强效应减弱了近90%。他们进一步的研究认为，这三段缺失的序列原本正好是音猬基因一些转录因子的结合位点，蟒蛇的序列缺失让这些转录因子无法正常工作，使得音猬基因表达水平大幅减弱，最终导致蟒蛇前肢完全退化，后肢部分退化。

弗朗西丝卡·利尔和马丁·科恩在验证其突变序列的功能时，同样借助于基因工程小鼠。他们将蟒蛇和蜥蜴的增强子zrs序列分别与一种报告基因——lacz基因构建成一个新基因，分别显微注射到小鼠受精卵，培育出11.5天的转基因小鼠胚胎。通过染色，lacz基因产物会呈蓝色，可以通过蓝色深浅直观地判断lacz基因表达水平的高低，结果含蜥蜴增强子序列的小鼠胚胎前后肢报告基因均有较强的表达，而含蟒蛇增强子序列的小鼠胚胎前后肢报告基因则只有很微弱的表达，表明缺失了三段序列的蟒蛇zrs增强子的确与其四肢退化有关。不过该研究并没有对小鼠四肢发育进行后续研究，也没有培育出维瑟尔教授研究小组那样活的转基因小鼠，无法从转基因小鼠四肢骨骼发育形态进一步确证这些突变序列的功能。

参考文献：

1.evgeny z. kvon, olga k. kamneva, uirá s. melo, iros barozzi, marco osterwalder et al,.progressive loss of function in a limb enhancer during snake evolution. cell. 2016,167(3):633-642.

2.martill, d. m., tischlinger, h. & longrich, n. r. a four-legged snake from the early cretaceous of gondwana. science, 2015. 349, 416–419.

3.leal, f. & cohn, m. j. loss and re-emergence of legs in snakes by modular evolution of sonic hedgehog and hoxd enhancers. curr biol. 2016:26(21),2966-2973.

4.sagai, t., hosoya, m., mizushina, y., tamura, m. & shiroishi, t. elimination of a long-rangecis-regulatory module causes complete loss of limb-specific shh expression and truncation of the mouse limb. development. 2005,132: 797–803.