详解2019诺奖研究：低氧信号机制的发现有多重要-凯发游戏

撰文 | 郭晓强

注：本文来自上海《科学》杂志，经授权转载。

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氧气是绝大多数高等生物所必需物质，然而生命为适应低氧环境而进化出一个保守的低氧信号应答机制，通过感知氧含量而启动不同应答。低氧信号机制的阐明一方面深化对多种生理现象的理解和认识，另一方面也为相关疾病治疗提供全新策略。

氧（oxygen，o）是地壳中含量最多的元素，基本以氧化物（含有氧的化合物）形式存在；而两个氧原子构成的氧分子（o2）则是大气基本成分之一，对于地球上大多数生物尤其是高等生物而言具有必不可少的作用。然而，氧对生命而言具有双刃剑作用，一方面不可或缺，因为大部分生命每时每刻的能量代谢和其他生理过程都依赖氧的参与；另一方面氧还具有损伤作用，氧化过程产生的自由基等副产物是危害健康重要因素之一。因此，氧的感知和调控就成为科学家关注的重要问题。

氧的发现和作用

尽管氧在自然界已存在上亿年，但真正被认知并开始研究才仅二百多年历史。十八世纪七十年代，英国化学家普里斯特利（joseph priestley）、瑞典化学家舍勒(carl wilhelm scheele)以及法国化学家拉瓦锡（antoine laurent lavoisier）几乎同时发现氧的存在，特别是拉瓦锡还对氧的作用进行了科学阐述，提出燃烧本质是物质与氧的反应，摈弃了当时主流的“燃素说”，从而极大推动化学的快速发展。拉瓦锡还做出另一项重大贡献，在严格实验数据基础上提出生物呼吸过程与物质燃烧在本质上类似，这一重要论断标志着生物氧化（早期也称为生物燃烧）领域的诞生。

二十世纪，氧在生命过程中的作用和机制得到全面阐述。氧的归宿就是生成氧化物，该过程又可分为两种类型。一种是营养物质（如葡萄糖、脂肪酸等）的氧化过程，该过程往往伴随能量产生（包括atp生成和热量释放），参与酶被称为氧化酶（或还原酶）。另一类为非直接供能的物质（如代谢废物、毒物等）的加氧过程，该过程主要为增加物质溶解性，进而有利于排泄，参与酶称为加氧酶，此外部分生物大分子（如dna和蛋白质等）也存在这一过程，其目的在于影响生物分子结构和活性。总之，这些研究清晰表明氧对生命具有至关重要的意义。

红细胞生成素和低氧诱导因子

氧的重要性意味着生命无法长期隔离氧气，但机体在特殊情况（如高原环境和短时期窒息等）时会面临氧供应不足（低氧）状况，如何适应就成为生物体必须解决的重大问题。

二十世纪六十年代，科学家发现低氧环境下机体内红细胞数量会急剧增加，以增加对氧的携带和运输能力，从而达到缓解机体缺氧状况。深入研究发现这是源于低氧可增加促红细胞生成素（erythropoietin, epo）含量，epo不仅成为第一个明确的低氧诱导分子，而且人重组epo还被广泛应用于贫血等疾病的治疗。

epo的发现和应用同时也提出一个基本科学问题，那就是epo在低氧环境下的调控机制。1977年人epo蛋白被纯化成功，1985年人epo基因也被成功克隆，这些进展为进一步机制研究奠定坚实基础。不久，美国约翰霍普金斯大学遗传学家西门扎（gregg l. semenza）开始尝试解决这一问题。

西门扎背景是儿科学和医学遗传学，最初研究方向是地中海贫血的发病原因。西门扎在研究过程中无意间接触到epo，从而从根本上改变了研究方向。西门扎和同事将人的epo基因转入小鼠体内，制备出的转基因小鼠可生成更多红细胞。这一结果说明人的epo基因不仅可在小鼠体内表达，而且还可发挥正常的从红细胞生成功能。

在此基础上，西门扎决定进一步研究epo的表达调控。1992年，西门扎和学生在epo调控区（非编码蛋白序列）鉴定出一段与低氧诱导相关的保守dna序列，将这段序列连接到非低氧诱导基因后，可引起这些基因表达也受低氧调控，这一序列后被命名低氧应答元件（hypoxia response element, hre）[1]。西门扎推测由于hre是一段dna序列，因此理论上还存在对应的特异因子，该因子可在细胞核内与hre结合并增加基因表达。为验证该假说，西门扎从低氧处理后的细胞核提取物中分离并纯化得到一种蛋白质，该蛋白质可与hre特异结合。特别是该蛋白质只在低氧环境下稳定存在，常氧时蛋白质几近消失，鉴于这种特性而将其命名为低氧诱导因子1（hypoxia-inducible factor 1, hif-1）[2]。对hif-1组成分析发现其含有两种亚基，分别命名为hif-1α和hif-1β，其中hif-1β与前期发现的芳香烃受体核转位蛋白(aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator，arnt) 相同，只有hif-1α为新成分。在性质方面，hif-1α蛋白含量受氧的严格调控，只存在于低氧环境下下，而hif-1β蛋白为组成型，其含量与氧的浓度无关。

西门扎随后发现，机体大部分组织都存在稳定的hif-1α蛋白，然而epo只在肾脏和肝脏中表达，这一事实表明hif-1的作用应不局限于epo调节。在这一思路指导下，西门扎小组鉴定出多种hif-1调节的低氧诱导基因，包括血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，vegf）、葡萄糖转运蛋白1（glucose transporter-1,glut1）。

hif-1发现的意义在于说明低氧感知是一个非常重要的生物学过程，具有广泛的生物学意义，从而吸引更多研究人员加入对这个问题的研究之中，极大推动了该领域的快速发展。hif的发现证明其对低氧应答基因表达具有重要影响，然而仍有许多问题需要回答，首要问题是常氧环境下蛋白稳定性降低原因。此时一项看起来毫无关联的研究为此提供了重要线索。

vhl与低氧诱导因子

1904年，德国眼科医生冯•希佩尔（eugen von hippel）首次描述了一种眼血管瘤；1927年，瑞典病理学家林道（arvid vilhelm lindau）则独立描述了一种小脑和脊髓血管瘤。后来发现，两位研究人员描述的其实是同一疾病，因此从60年代开始将这种疾病统一命名为冯•希佩尔-林道疾病（von hippel-lindau (vhl) disease）。vhl是一种遗传性疾病，患者发生血管瘤、血管母细胞瘤和肾癌等几率极大增加，并且这些肿瘤血管化现象尤其明显，体内生成大量vegf和epo，这些特征预示着vhl可能与低氧有一定关联。1993年，该病致病基因vhl被成功测序，发现其发生功能失活性突变，意味着vhl应为一种抑癌基因，这一进展为深入研究作用机制奠定坚实基础。

美国分子生物学家凯林（william kaelin）最初想法是成为一名临床医生，在约翰霍普金斯医院完成实习和培训后进入丹娜法伯癌症研究院(dana-farber cancer institute)从事临床肿瘤学研究。恰逢第一个抑癌基因rb鉴定成功，该基因突变可导致视网膜母细胞瘤发生，这一进展掀起了抑癌基因的寻找热潮，原本对基础研究几无兴趣的凯林也逐渐改变看法，经过一段时间实验室系统培训后于1992年开始自己的抑癌基因研究计划，选择对象是vhl突变相关的肾癌。

凯林决定研究vhl突变造成肾癌发生的机制。1996年，凯林与同事制备成功vhl突变细胞系，然后将其与vhl基因正常细胞进行比较。他们意外发现，vhl突变细胞即使在常氧情况下仍可大量表达低氧诱导基因如vegf等，当为其转入正常vhl基因后这种现象消失。凯林进一步研究发现vhl突变细胞之所以在常氧环境下表达低氧诱导基因是由于原本应降解的hif-1α却可以正常存在[3]，这一结果说明vhl基因突变破坏了hif-1α在常氧下的降解能力。

凯林的发现很好解释了肾癌高度血管化的现象，然而提出一个新问题，即vhl蛋白在常氧环境下降解hif-1α的机制。

vhl与泛素化

80年代末，英国牛津大学分子生物学家拉特克利夫（sir peter john ratcliffe）也开始关注epo表达调控机制，他专业背景为肾脏生理，而科研原动力来自于肾脏器官对氧的敏感性。拉特克利夫在90年代早期也发现了epo中存在hre，并对其调控作用进行了初步研究。拉特克利夫还发现肝癌细胞移植入小鼠体内成瘤后，在缺氧区出现大量低氧诱导基因如vegf和glut1等，当破坏hif-1则使低氧诱导基因表达不在升高，并且肿瘤组织生长减缓。这些结果一方面证明了低氧信号通路广泛的生物学作用，而且也与凯林肾癌的结果产生了密切联系。

待hif-1α和vhl先后发现后，拉特克利夫对二者之间的兴趣产生了浓厚兴趣。由于细胞内蛋白质降解需要通过溶酶体途径或蛋白酶体途径，而hif-1α的降解模式更像蛋白酶体，后续研究也证明这一推测，故此开始考虑vhl在蛋白质泛素化过程中的作用。多项研究表明，vhl蛋白其实是泛素连接酶（e3）复合物的关键亚基，而拉特克利夫则进一步证明vhl蛋白可与hif-1α相互作用进而在低氧环境下促进其泛素化和降解[4]。多家实验室还在结构层面证实了拉特克利夫的发现，确定了vhl催化的hif-1α泛素化是造成常氧环境下hif-1α蛋白稳定性下降的主要原因。

拉特克利夫等的发现很好解释了肾癌vhl基因突变后hif-1α含量增加和低氧信号通路增强的问题，然而仍面临一个亟待解决的重大问题，那就是细胞低氧感知和vhl启动hif-1α泛素化如何实现有机整合。

phd与氧感知

靶蛋白进行泛素化修饰前往往先进行其他类型修饰以区分它与原蛋白差异，避免被错误降解，最常见的修饰为磷酸化，然而凯林和拉特克利夫发现抑制蛋白磷酸化过程并不影响hif-1α常氧下降解速率，而减少铁离子或氧含量则显著增加hif-1α稳定性，说明该修饰过程与铁和氧相关。2011年，两个小组采用类似策略，首先将泛素化途径阻断从而造成hif-1α蛋白积累，进一步分析发现这些积累hif-1α的脯氨酸（proline）存在羟基化修饰，当阻断羟基化则破坏hif-1α被vhl蛋白的识别和随后的泛素化而使蛋白稳定性增加[5,6]。

不久，拉特克利夫和同事进一步从果蝇中鉴定出一种双加氧酶，其负责催化hif-1α的羟基化[7]。哺乳动物也存在双加氧酶，称为脯氨酰羟化酶结构域蛋白（prolyl hydroxylase domain, phd），共包含3个成员，分别为phd1、phd2和phd3。phd酶活性受o2、fe2 、维生素c和α-酮戊二酸等的影响，这一发现的意义在于为调控phd酶活性提供重要思路。至此，低氧信号通路基本组分被鉴定完毕。

三位科学家和低氧信号

复杂的低氧信号通路

三位科学家的研究奠定了低氧信号通路基本框架，后续大量研究进一步拓展了这一过程的详细分子途径。

首先，低氧信号通路存在更多中介分子。目前，在人类中共发现三种hif-α，分别为hif-1α、hif-2α和hif-3α，两种hif-β，分别为hif-1β和hif-2β，采用不同组合可形成多种异源二聚体，从而使低氧应答机制更加丰富多样化。除phd受氧调节外，还鉴定出另一种羟基化酶fih（factor inhibiting hif,fih），其催化的hif-α羟基化并不影响hif-α蛋白稳定性，而是阻碍其与转录共激活蛋白结合，从而造成转录激活效应降低。因此，常氧情况下hif-α的两种羟基化修饰可实现蛋白含量和转录活性双重抑制，从而保证低氧诱导基因只能严格在低氧环境下表达[8]。此外，hif复合物调节靶基因表达时还常需要其他元件（作为转录共激活蛋白发挥活性）参与，著名的如组蛋白乙酰转移酶p300，我们最近研究表明多种组蛋白去甲基化酶如jmjd1a和jmjd3等也参与了低氧信号通路，从而更加深化对低氧适应机制的理解。

其次，低氧信号通路与其他信号通路存在复杂的互作，最著名的是mtor信号通路。mtor（mechanistic target of rapamycin）是一种蛋白激酶，可将环境胁迫信号如营养缺乏等于细胞内蛋白合成、脂类合成等实现有机整合。低氧信号通路和mtor信号通路通过协调作用而实现细胞则恶劣生存环境下的适应。

研究意义

低氧信号通路的发现开创了一个全新研究领域，具有重要的理论价值和巨大的应用潜力。低氧信号通路阐明了机体在不利环境下的适应机制，包括低氧促进红细胞生成增多、耗氧量降低等代偿性效应以减少氧不足造成的机体损伤。低氧信号通路对一些组织氧化损伤和炎症具有保护作用，如冠状动脉疾病、外周动脉疾病、伤口愈合、器官移植排斥和结肠炎等。然而过度低氧信号也可导致机体损伤，包括遗传性红细胞增多症、慢性缺血性心肌病和阻塞性睡眠呼吸暂停等[9]。特别是大多数固体肿瘤都存在低氧信号通路异常活化现象，并且与患者预后呈负相关。低氧信号通路通过增加营养物质如葡萄糖摄取、血管生成等策略最终促进了癌细胞的增殖和转移。

低氧信号通路的关键元件还成为疾病治疗重要靶点，从而为多种疾病治疗提供新策略。phd抑制剂可有效稳定hif-α蛋白稳定性，进而增加低氧靶基因表达，这一策略可应用于治疗贫血、缺氧引起的组织损伤等。抑制低氧信号通路则在癌症治疗方面显示出巨大价值。以肾癌为例，肾癌是低氧效应最明显肿瘤，因为vhl突变在肾癌中发生比例最高（达70%左右，其他肿瘤比例较低甚至缺乏），最早开发的vegf抑制剂——贝伐单抗作用机制在于抑制血管形成以减降低癌细胞营养供应，而最近开发的特异性hif-2α拮抗剂pt2399则在细胞、动物和临床前实验中显示出较好的治疗效果[10]。

总之，低氧信号通路的阐明极大拓展了生命科学和医学的研究领域，其重要性也越来越多得到科学界的认可，三位科学家西门扎、凯林和拉特克利夫因此于2016年分享美国有“小诺贝尔奖”之称的拉斯克基础医学奖（albert lasker award for basic medical research），此外还分享2010年加拿大的盖尔德纳国际奖（gairdner international award）等，随着研究深入和临床广泛应用，三位科学家也有望将来分享诺贝尔生理学或医学奖。

参考资料

[1] semenza gl, nejfelt mk, chi sm, et al. hypoxia-inducible nuclear factors bind to an enhancer located 3' to the human erythropoietin gene. proc natl acad sci usa, 1991, 88(13):5680.

[2] wang gl, semenza gl. purification and characterization of hypoxia-inducible factor 1. j biol chem, 1995, 270(3): 1230.

[3] iliopoulos o, levy ap, jiang c, et al. negative regulation of hypoxia-inducible genes by the von hippel-lindau protein. proc natl acad sci usa, 1996, 93(20):10595.

[4] maxwell ph, wiesener ms, chang gw, et al. the tumour suppressor protein vhl targets hypoxia-inducible factors for oxygen-dependent proteolysis. nature, 1999, 399(6733):271.

[5]  ivan m, kondo k, yang h, et al. hifalpha targeted for vhl-mediated destruction by proline hydroxylation: implications for o2sensing.science, 2001,292(5516):464.

[6] jaakkola p, mole dr, tian ym, et al. targeting of hif-alpha to the von hippel-lindau ubiquitylation complex by o2-regulated prolyl hydroxylation. science, 2001, 292(5516):468.

[7] epstein ac, gleadle jm, mcneill la, et al. c. elegans egl-9 and mammalian homologs define a family of dioxygenases that regulate hif by prolyl hydroxylation. cell, 2001, 107(1):43.

[8] hurst jh. william kaelin, peter ratcliffe, and gregg semenza receive the 2016 albert lasker basic medical research award. j clin invest, 2016, 126(10):3628.

[9] ratcliffe pj. oxygen sensing and hypoxia signalling pathways in animals: the implications of physiology for cancer. j physiol, 2013,591(8):2027.

[10] ricketts cj, crooks dr, linehan wm. targeting hif2α in clear-cell renal cell carcinoma. cancer cell, 2016, 30(4):515.