本庶佑：盯住大问题的探索者
整理·撰文 | 定一
编辑 | 耿爽
前情回顾
少年时代便已崭露头角的本庶佑，修完博士课程后来到美国，在位于华盛顿的卡内基研究所唐纳尔·布朗（donald brown）实验室继续深造。
布朗教授打开了本庶佑在免疫学方面的眼界，激发了他对免疫学的极大兴趣。同时，他在治学态度和方法上有两点对本庶佑产生了重要的影响。第一点是“绝不放弃”；第二点是必须要能够问出“大问题（big question）”。
本庶佑后来回忆说：
通常在我们提出大问题后，会引出许多小问题。有些人会走进这些小路上而出不来，把原来提出的大问题给忘记了。布朗教授提醒我，要盯住你主要的大问题。
“盯住你的问题（stick to the question）”后来就成了京大本庶佑研究室的座右铭。
卡内基研究所
布朗教授当时正在对青蛙的核糖体rna基因进行高纯度的分离，并以此分析基因的构造。本庶佑向布朗提出，自己想研究核糖体rna基因是如何表达的，希望能够在试管中对此进行重组。恰好，布朗最优秀的学生利达当时正在做基因表达方面的研究，布朗就让本庶跟着利达一起做。但是这个课题在当时难度较大，本庶佑花了一年左右的时间挑战它，却没有什么收获。
接下来，他又开始使用蝌蚪来研究发生后初期阶段的核糖体rna的转录控制，想在分子层面上对基因间的显性、隐性现象（核仁显性）做出解释。但这项研究也只进行了半年，没能最后完成。
在卡内基研究所的一年半，本庶佑虽然没有取得具体的成果，但吸收了真核生物的分子生物学的概念和思维方式，也掌握了相关的研究手法。此外，在卡内基研究所，本庶佑有许多机会与那些正在进行基因转录控制研究的第一流学者一起交流，听取他们的研究报告，这同样让他受益匪浅。
本庶佑对免疫学的兴趣，成于当时免疫学的兴起，关键的契机则在于此前布朗教授做的一次报告。布朗教授在这次报告中根据核糖体rna基因构造的类推，提出了一个关于抗体多样性产生机制的新假说：重复排列假说。
那时人们知道，核糖体对于蛋白合成是必须的，在需要大量蛋白质合成的发生初期，核糖体rna基因会大量增加。在基因组内排列着数百个核糖体rna基因，在它们之间存在着间隔区，其排列略有差异而又相似，基因与间隔区不断重复数百次。布朗教授的假说是说，抗体的基因可变区（v区）和恒定区（c区），分别类比核糖体rna基因和间隔区，也同样存在交互重复排列，从而成为抗体多样性的分子基础。而要证明这一假说，从实验角度推理，只要测出基因组内基因的数目即可。
这个报告给了年轻的本庶佑很大的震撼：首先，在科学研究中，提出假说非常重要，而假说又必须是以可验证的方式提出，否则就只不过是提供了一个有趣的谈资而已；其次，布朗教授的这个假说激发了本庶佑对免疫学的极大兴趣。他想测出基因组内基因的数目，验证布朗假说，于是就对布朗教授说：“我在卡内基研究所的研究结束后，希望接下来能够做关于抗体基因的研究。您认为我去哪里比较合适？”
布朗推荐了几个地方，本庶佑考虑再三，认为nih的莱德尔（p. leder）做得最好，就决定转到nih去试试。
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后来的事实证明，本庶佑的这个决定是非常正确的。
当时，抗体已经被证实可以控制感染等疾病，同时抗体的分离技术也日益成熟，但对产生抗体多样性的分子机制并不清楚，是竞争激烈的热门课题，包括nih的莱德尔、mit的利根川进（susumu tonegawa,1987年诺奖得主）在内，全世界有十个左右最有实力的团队正展开着激烈的竞争。
为了挑战这个课题，从器材制作到组织分工，莱德尔团队都做了高度合理和细致缜密的安排和规划。在这里，本庶佑如鱼得水。他夜以继日，异常勤奋地工作，进一步展示了他科学研究的才能。
要测出抗体基因的个数，就需要对基因进行纯化。具体地说，就是从mrna反转录出互补dna（cdna），通过对cdna的纯化完成目标mrna的纯化。当时世界上还没有基因克隆技术，本庶佑就通过这种方式来测量基因的个数。经过反复的尝试，本庶佑得出清晰的结论：在基因组中抗体恒定区（c区）的基因只有一个。这个结论推翻了布朗假说。
在科学研究中，假说被推翻并不是一件坏事。因为假说一旦被明确推翻，研究者就可以转而放手研究下一个问题。因此，在本庶佑看来，自己的这一研究成果也算是对布朗教授盛情帮助的一份回报。
在莱德尔实验室，不到两年的时间内，本庶佑发表了五篇论文。但本庶佑在nih的收获远不止这五篇论文。这种置身于世界学术最前沿的激烈竞争环境中的切身体验，对本庶佑后来的研究有很大的影响。
本庶佑从莱德尔那里学到的另外一点是：如何呈现自己的研究成果。研究者千辛万苦取得的成果需要让人看懂，使人理解并被你说服。这也是一门艺术，需要运用一些技巧、逻辑和恰当的表达方式。在这一点上，莱德尔的言传身教使本庶佑受益良多。后来有美国医学家说：本庶佑不仅是最好的科学家，而且是最好的沟通者。这至少应该部分地归功于莱德尔。
莱德尔
本庶佑在研究方面进展非常顺利，他的出色表现也令莱德尔刮目相看。在他离开日本到美国已经三年半时，莱德尔建议他留在美国，独立组建自己的团队继续研究。留在美国，还是回到日本，这是一个大问题。考虑再三，本庶佑决定先回国看看。
促使本庶佑做出这个决定的原因主要有两个。第一，确实如莱德尔所说，当时有不少日本人在美国做了很漂亮的工作，但是一回到日本，不久就开始写一些综述文章和书籍，再不久就在国际上销声匿迹了。这一点激起了刚三十出头、血气方刚的本庶佑的好胜心：他想证明自己即使回国也同样可以做出一流的工作来。
另一个原因，是他的家人也在美国生活，多多少少还是感受到了一些种族歧视。本庶佑感觉到，在实验室里是以工作的水平和质量论高下的，但是一走出实验室，并不是所有人都能用平等的国际视野来看待有色人种。
东大时代的五年和抗体类型转换模型
1974年，在启蒙老师早石修教授的介绍下，本庶佑决定回国到东京大学真野嘉长教授的实验室担任助手。真野嘉长教授传话给本庶佑：“在我这里，不管你做什么研究都没有问题，但要做高质量的研究。”
但是等到本庶佑实际回国一看，才发现：没有实验器材，没有材料，也没有经费。因为本庶佑是以助手的身份回来，既申请不到多少研究经费，也不容易找到共同研究者。但在如此的困难条件下，本庶佑仍然不忘初心，坚信自己回国是为了在日本同样做出第一流的工作，也是为了开创日本的基因研究。
于是，本庶佑振作精神，卷起袖子，自己动手开始制作各种实验器材。起初，他连寻找实验用的纯种小鼠也颇费了一番周折，最后终于找到了一个专业的卖家，但一只小鼠要一千日元，这在当时可是很贵的价钱。本庶佑第一次就买了十只。卖小鼠的大叔把小鼠装在盒子里，外面用敷巾很谨慎地层层包好，然后小心翼翼地抱着盒子坐上电车，送到大学的实验室来。
幸运的是，就在这时，本庶佑回国前在美国申请的研究经费也批准下来了，资金方面的状况就有了好转。美国政府对已经离开美国的研究人员仍然发放此前申请的研究经费，这使本庶佑感慨良多，也非常感激。同时，在美国的同行朋友也应他的要求，免费寄来日本买不到的试剂和材料。
到了第三年，情况就有了明显好转。本庶佑的团队聚集了一些人，研究经费也在许多人的资助下，逐渐有了着落。
接下来的大问题是：在东大研究什么课题？年长的师友们说，如果继续做抗体基因研究的话，跟美国同行相比不可能有优势。他们建议本庶佑改做其他方面的研究。但本庶佑认为，既然决定做，就要做自己最想做的事情。万一失败了，就回到乡下做个医生，悠然自得地过个小日子算了（早在京大读研究生的时候，本庶佑已经通过了国家医师资格考试）。
于是，本庶佑决定迎难而上，继续向免疫学最核心的课题发起挑战。这次，他聚焦的不再是之前在美国研究的抗体轻链（l链）可变区的多样性的机制，而是抗体重链（h链）的多样性。由于h链基因大，实验处理起来麻烦，当时包括美国科学家在内的绝大多数科学家都不太愿意研究h链。但本庶佑在东京大学的前三年时间，把精力集中在h链的研究上，如痴如醉。
当时已知抗体有多种类型：产生抗体的淋巴球b细胞为了高效地排除各种抗原，先是产生igm这一类型的抗体，然后根据侵入的抗原的种类以及侵入位置（粘膜：肠、气管），接着产生ige及iga等不同类型的抗体。根据抗体类型的不同，抗原结合后的清除方式也有不同。为了弄清抗体类型的产生机制，本庶佑从移植到珍贵的小白鼠的骨髓瘤中提取出抗体的mrna，制成cdna，然后检测基因的数目。
在东大时，本庶佑每天要坐电车往返于自己家和大学之间，单程就要一个半小时。他发现，自己在人满为患的电车里只要能找到位子坐下，就能集中精神，工作效率极高。就这样，本庶佑选择乘坐能找到座位的电车上下班，而每天往返共三个小时的通勤时间就是他整理数据的最好时间。
有一天，本庶佑在回家的电车上突然觉察到：骨髓瘤细胞的抗体基因在不同的类型中有不同的缺失。这会不会是与抗原结合后的抗体清除相关的恒定区基因发生改变，使基因的一部分缺失，从而改变了抗体类型？如果这个假设成立，他就可以设计出一个与这一模型一致的h链基因的特定顺序来做实验验证。
这个想法使本庶佑非常兴奋。他回家后首先翻遍所有的笔记，检查是否有数据与假设模型矛盾，结果发现没有任何已知数据与假设模型矛盾。第二天，他就把这个假设模型告诉自己的团队，并且马上着手设计实验，对模型进行验证。
这个模型就是1978年发表在《美国科学院院报》上的《h链基因的构成与抗体基因缺失模型》，后来又被《自然》杂志介绍，在国际学界产生了很大的反响。这篇文章第一次明确指出，抗体基因的缺失是在类型转换时产生的。这对此后的发生学研究也有很大的影响。
本庶佑提出的“抗体类型转换模型（class switching model）”奠定了他在基因研究方面的学术地位，他也因此成为备受日本各界瞩目的学术明星。
当然，要最终证明自己的模型，还需要克隆h链的基因，检测碱基序列，确认缺失状况。因此，1977年本庶佑再次来到美国nih莱德尔研究室。这次，他是来学习分子克隆技术的。当时在日本还没有这项技术，即使在美国，掌握这项技术的研究人员也屈指可数。
此时的本庶佑虽有留在美国继续做研究的念头，但因为这几年他在日本的研究已经逐渐走上了正轨，所以就又把这一念头搁置在一边。另外，本庶佑在掌握了分子克隆和基因重组技术之后，认为自己在日本同样可以完成目前的课题。
不过，本庶佑回到日本后要想用上自己刚学到的技术，还是得亲自上手，一个一个地制作实验器材。此时的本庶佑完全沉迷于自己的研究。虽然验证的过程很辛苦，但是新奇有趣、让人无比兴奋的工作一个接一个地冒出来。
最重要的是，对于自己提出的模型是否正确，本庶佑希望亲手验证。因为抗体的基因在基因组内只有一个拷贝，所以实验要获得成功很不容易。当他确认在dna凝胶电泳中捕获到抗体h链的基因时，兴奋喜悦之情难以言表。本庶佑后来回忆说：“这是一个研究者最大的乐趣，也正因为体验到了这种乐趣，我永远无法舍弃自己的研究工作。”
当本庶佑第一次捕获到h链基因时，他还在东京大学担任教职。此后，他使用捕获的基因，明确了基因的构造，模型的正确性和缺失的产生。更进一步地，他捕获了完整的抗体基因，明确了碱基序列。至此，关于基因的构造及缺失的概略模型终于确立。
此时已是1982年，距离本庶佑从东京大学转到大阪大学担任教职已有三个年头了。
阪大实验室的启动和探索
1979年，大阪大学任命本庶佑为教授。三十七岁就任大阪大学的教授，这在当时的日本是罕见的。再加上他的英俊帅气的相貌，一下子成为日本电视、杂志等各种媒体追捧和跟踪报道的学术明星和“男神”。同时，“抗体类型转换模型”使他享誉学界，扩大了他与同行之间的交流。
刚到大阪大学时，本庶佑忙于撰写论文和启动实验室，并没有太多的时间做实验。但随着实验室逐渐步入正轨，本庶佑重新进入状态。当时大阪大学校长是日本免疫学的领袖人物山村雄一，居然破天荒地要借钱给本庶佑，全力支持他启动实验室。山村雄一对本庶佑说：“你总有一天会弄到钱的，到时候再慢慢地还给学校不迟。”这种宽松的做法在以管理严谨、规范著称的日本国立大学是很难想象的，使得本庶佑深为感动。本庶佑的研究正是在这种灵活性和包容性之下取得了进展。
在阪大工作期间（1979-1984年），本庶佑的研究进展顺利，在国际专业期刊上一共发表了六十七篇论文（含联名）。其中最重要的成果，就是上面提到的他在1982年完成的工作：彻底弄清了抗体基因的碱基序列及构造。
1984年，启蒙老师早石修从京大正式退休，本庶佑也从阪大回到京大，接替了老师的位置。此后，他一直都在京大工作，没有离开过。
在京大的第一个十年和aid的发现
本庶佑到京大后，一边摸索尝试，一边思考接下来的研究课题。他最想研究的，还是抗体基因缺失的机制。他想弄明白一系列问题：引起基因重组的酶到底是什么？对这种功能的酶活性进行调节的物质又是什么？决定抗原清除方式的是抗体的类型，这些类型又是由什么决定的？如何进行重组的？而最重要的问题，是在这些现象的背后，存在着怎样的调控机制？这是本庶佑最想弄清楚的问题。实际上，这个目标从一开始就有，也一直没有放弃过，贯穿着本庶佑迄今为止的整个研究生涯。
当这一系列课题还处于摸索尝试阶段，1984到1986年期间，本庶佑成功地分离出控制抗体类型转换的细胞因子白细胞介素4和白细胞介素5（il-4、il-5），并明确了它们的基因构造和功能。这样，b淋巴细胞的不同功能，可以通过il-4、il-5来解释。这一发现，意味着存在外部因子对b细胞进行控制，从而为弄清抗体类型转换的机制提供了线索。
il-4和il-5的发现虽然有其意义，但对于本庶佑所要研究的一系列问题来说，难免有隔靴搔痒之感。他很清楚，自己的实验还缺少一种必要的材料。但他没有想到的是，自己寻找这一材料居然要花费十年时间。
在本庶佑设计的实验中，需要对培养的细胞进行可控的抗体类型转换。但这种只在给予刺激时才会高频度地产生抗体类型转换的开关型细胞一直都找不到。他从不少合作者那里获取了细胞，但效果都不能令人满意。如果从零开始做，也不容易。这时候着急也没用，他只好花时间慢慢找。
从1991年起，受nih福格蒂学者项目的邀请，本庶佑连续五年，每年在nih作为访问学者呆三个月。在那里，本庶佑可以第一时间接触到最新、最前沿的学术信息。这对于他找到合适的细胞很有帮助。
实际上，1996年本庶佑终于找到了满意的小鼠细胞，也找到了抗体类型转换时表达的关键酶基因。这就是aid（activation induced cytidine deamainse，活化诱导的胞苷脱氨基酶）。他对aid基因敲除小鼠进行观察，发现它的b细胞只产生igm抗体，没有出现iga，igg等抗体类型转换后的类型。而且，在正常鼠中为了增强对抗原的特异性，抗体与抗原结合的可变区（v区）序列会有大量的变异进入，但敲除aid基因后，抗体v区完全没有发生变异。
这个结果大大出乎本庶佑的意料，也让他感到异常兴奋。以前人们普遍认为，可变区（v）和恒定区（c）的多样性的生成机制是各自分开的，本庶佑的结果却显示，aid一个酶同时控制着两个反应。经过一连串的实验，本庶佑验证了，在抗体基因里刻下抗原记忆的，正是aid。获得性免疫的一部分谜题因此破解。
从1978年抗体类型转换模型的提出，到1999年aid的发现，二十一年的时光弹指一挥间，人类对免疫的理解也有了很大的进步。在这进步的过程中，本庶佑一直是走在最前面的一个。
两项技术发明
在生物学的发展过程中，技术革新起了重要的促进作用。比如，技术革新使得原来看不到的东西现在能够看到了，原来无法分离的分子现在可以捕捉到了，以前无法准确检测的东西因为新方法就可以准确地检测了。本庶佑认为新技术、新方法的开发对于生物学的发展非常重要，所以他一直都很注重这方面的工作。
本庶佑在研究过程中，开发了两种新方法。一种是1986年发表的“mrna文库注入法”。使用这种方法，科研人员可以分离出il-4、il-5等细胞因子。
还有一种是他在1993年开发的“信号肽捕获（signal sequence trap，即sst）法”。科研人员可以通过这种方法捕获大量的细胞因子和受体分子。本庶佑还就这种方法申请了专利，美国的风投公司在该专利的基础上又进行了改良，提高了捕获效率。该方法被应用于分泌蛋白质及细胞表面分子的分离，在增殖因子及其受体的研究和临床应用中大显身手。
作为一名生物学家，有了抗体类型转换模型和aid这两个发现就足以自豪了，但本庶佑并没有满足，好奇心依旧驱使着他不断地探索新的未知，直到走上诺奖领奖台。欢迎关注“赛先生”明日推送。
文章头图及封面图片来源：u-shizuoka-ken.ac.jp
文中插图除特别标注外均来自本庶佑诺奖演讲演示文稿
